Пространственно ограниченные драйверы и популяции переходных клеток взаимодействуют с микроокружением при необработанном и химиотерапевтическом лечении.

Nature Genetics, том 54, страницы 1390–1405 (2022 г.) Процитировать эту статью

27 тысяч доступов

23 цитаты

264 Альтметрика

Подробности о метриках

Аденокарцинома протоков поджелудочной железы — смертельное заболевание с ограниченными возможностями лечения и плохой выживаемостью. Мы изучили 83 пространственных образца от 31 пациента (11 ранее не получавших лечения и 20 получавших лечение) с использованием секвенирования одноклеточной/ядерной РНК, объемной протеогеномики, пространственной транскриптомики и клеточной визуализации. Субпопуляции опухолевых клеток демонстрировали признаки пролиферации, передачи сигналов KRAS, клеточного стресса и эпителиально-мезенхимального перехода. Картирование мутаций и количество копий отличают опухолевые популяции от нормальных и переходных клеток, включая ацинарно-протоковую метаплазию и интраэпителиальную неоплазию поджелудочной железы. Деконволюция пространственных транскриптомных данных с помощью патологии выявила опухоли и переходные субпопуляции с отчетливыми гистологическими особенностями. Мы продемонстрировали скоординированную экспрессию TIGIT в истощенных и регуляторных Т-клетках и нектина в опухолевых клетках. Устойчивые к химиотерапии образцы содержат тройное обогащение фибробластов, связанных с воспалительным раком, которые активируют металлотионеины. Наше исследование показывает более глубокое понимание сложной субструктуры опухолей аденокарциномы протоков поджелудочной железы, что может помочь улучшить терапию пациентов с этим заболеванием.

Аденокарцинома протоков поджелудочной железы (PDAC) имеет 11% 5-летнюю выживаемость1 из-за позднего выявления, ранних метастазов и резистентности к терапии2,3,4,5,6. Лечением первой линии является хирургическое вмешательство с последующей лучевой и/или химиотерапией7,8, при этом возможности иммунотерапии ограничены9,10. Такие драйверы, как KRAS, TP53, CDKN2A и SMAD4 (Комитет по номенклатуре генов HUGO при Европейском институте биоинформатики, https://www.genenames.org/), были идентифицированы11 как имеющие классические и базальноподобные подтипы транскрипции12,13.

Одноклеточные технологии позволяют проводить анализ независимо от содержимого опухоли и облегчают рассечение микроокружения опухоли (TME), роль которого в PDAC остается в значительной степени неизвестной. Например, были идентифицированы подтипы ассоциированных с раком фибробластов (CAF), а цитотоксические естественные киллеры (NK) и CD8+ Т-клетки часто количественно и функционально нарушены14,15,16,17. Это создает иммуносупрессивную, проопухолевую среду, но как это происходит, плохо понятно18,19. Растет признание ацинарно-протоковой метаплазии (АДМ), при которой ацинарные клетки начинают экспрессировать протоковые маркеры. Модели животных предполагают, что ацинарные клетки являются источником PDAC, когда экспрессируется KRAS(G12D)20,21,22,23, но эту гипотезу трудно оценить у людей из-за нехватки ацинарных клеток и клеток ADM, отобранных с разрешением одной клетки24,25 ,26,27,28. Недавние усилия были сосредоточены на ацинарной гетерогенности при хроническом панкреатите 29 и поджелудочной железе здорового человека 30, но адекватный отбор проб клеток ADM все еще отсутствует.

В рамках консорциума Human Tumor Atlas Network мы использовали пространственно отдельный подход с множественной выборкой для анализа 83 образцов PDAC у 31 пациента31. Образцы физически отделены друг от друга, что позволило исследовать как меж-, так и внутриопухолевую гетерогенность с помощью обширных омик, включая объемное секвенирование ДНК и РНК (РНК-секвенирование), массовую протеомику и фосфопротеомику, секвенирование одноклеточной и одноядерной РНК. (scRNA-seq и snRNA-seq соответственно), клеточная визуализация и пространственная транскриптомика. Мы идентифицировали и подтвердили переходные популяции и связанные с ними молекулярные характеристики в спектре от нормальной поджелудочной железы до PDAC, которые ранее были предложены в моделях на мышах. Мы охарактеризовали различное влияние химиотерапии на численность и программы транскрипции популяций опухолей и стромы, используя мультиомные подходы. Мы подчеркиваем необходимость пространственного секвенирования для характеристики поликлональных/гетерогенных опухолей PDAC.

Мы собрали 73 образца PDAC от 21 пациента, проходящих стандартное лечение, включая четыре образца нормальных прилегающих тканей. Группы лечения включали семь случаев, ранее не получавших лечения, восемь неоадъювантных случаев FOLFIRINOX (схема лечения, включающая фолиевую кислоту, 5-фторурацил, иринотекан и оксалиплатин), четыре неоадъювантных случая гемцитабин + наб-паклитаксел, один смешанный случай (FOLFIRINOX и гемцитабин + наб-паклитаксел). и один случай химиолучевой терапии (Chemo-RT) (дополнительная таблица 1). Из каждой опухоли пространственно брали образцы 2–4 раза, а сегменты образцов впоследствии использовали для получения гистологических, визуализирующих и омических данных; слайды с гематоксилином и эозином (H&E); scRNA-seq; протеомика и фосфопротеомика на основе масс-спектрометрии; массовое секвенирование всего экзома (WES); и массовое секвенирование РНК (рис. 1а, дополнительная таблица 2 и методы). Мы получили данные scRNA-секвенирования для всех 73 образцов, WES для 64 образцов и объемного секвенирования РНК для 65 образцов. Подгруппа (n = 30) прошла протеомную и фосфопротеомную характеристику с помощью тандемной массовой метки (TMT) 11 (рис. 1b). После контроля качества мы кластеризовали 232 764 клетки во всех образцах на основе профилей экспрессии и назначили типы клеток на основе экспрессии маркерного гена (рис. 1c, расширенные данные, рис. 1a–c, методы и дополнительное примечание). Используя долю опухолевых клеток в качестве показателя чистоты опухоли, оценки варьировались от 0,10% до 82,69% в разных образцах, в среднем 16,28%. Обзор патологии H&E показал, что различия в содержании опухолей у пациентов в разных образцах составляли в среднем 24% в диапазоне от 5% до 64% (расширенные данные, рис. 1d, Методы и дополнительное примечание), что соответствует проценту опухолей по результатам scRNA-seq (Pearson R. = 0,40, Р = 0,001). Анализ главных компонентов (PCA) объемных протеомных и фосфопротеомных данных подтверждает, что, хотя большинство внутриопухолевых областей кластеризуются близко, несколько образцов из одной и той же опухоли имеют существенную внутриопухолевую гетерогенность (расширенные данные, рис. 1e,f).

1,700 cells) and, consistent with previous studies, we observe PDAC-initiating mutations in KRAS and CDKN2A (from HT168P1) within PanIN populations52. PanIN exhibits increased expression of extracellular matrix-related genes (DCN, SPARC, SPON1), a diversity of collagens57, genes involved in acinar-to-ductal reprogramming (KLF4, MMP7)58,59 and other markers of early-stage malignancy (CXCL12, TIMP3, ITGA1, MUC5AC)60,61,62,63./p>700 cells) (Supplementary Data 3). We found PDAC cells harboring several distinct alterations (Fig. 4a,b). Cells expressing acinar and ductal markers clustered separately from acinar cells and tended to be between acinar cells and normal ductal lineages on the Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) (Duct-like1, Duct-like2), termed ADM_Normal, or between acinar and PanIN, denoted ADM_Tumor (Fig. 4b,c). While tumor and acinar cells express ductal and acinar markers in a mutually exclusive pattern, ADM cells express a combination, suggestive of an intermediate, reversible state (Fig. 4d). While both ADM_Tumor and ADM_Normal have decreased expression of acinar markers, they also have increased expression of PDAC markers and Duct-like1 markers, respectively. Following copy number analysis (CopyKAT, Methods), we found that a majority of predicted aneuploid cells are annotated as PanIN (n = 524), while only a handful (n = 30) in ADM_Tumor are labeled aneuploid (Fig. 4e,f). By mapping both KRAS and CDKN2A mutations, we identified several cells in the ADM_tumor population with either a KRAS mutation (n = 1) or CDKN2A mutation (n = 7), although this was not as widespread as the predicted PanIN populations (KRAS: 23 cells; CDKN2A: 163 cells) (Fig. 4g,h and Supplementary Data 3)./p> 8. All pathogenic or likely pathogenic variants had both their normal and tumor samples reviewed manually by us using the Integrative Genomics Viewer software./p>10,000) and too many unique molecular identifiers (>10,000); possible dead cell or a sign of cellular stress and apoptosis with too high proportion of mitochondrial gene expression over the total transcript counts (>10%). We constructed a Seurat object using the unfiltered feature-barcode matrix for each sample. Each sample was scaled and normalized using Seurat's ‘SCTransform’ function to correct for batch effects (with parameters: vars.to.regress = c(‘nCount_RNA’, ‘percent.mito’), variable.features n = 2,000). Any merged analysis or subsequent subsetting of cells/samples underwent the same scaling and normalization method. Cells were clustered using the original Louvain algorithm99 and top 30 PCA dimensions via ‘FindNeighbors’ and ‘FindClusters’ (with parameters: resolution = 0.5) functions. The resulting merged and normalized matrix was used for the subsequent analysis. Mouse data were aligned to refdata-gex-mm10-2020-A and GFP was added to the reference using the cellranger mkref function (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutorial_mr)./p> PN is actually observed, skipping cases of PT ≤ PN, to avoid over-correcting in the calculation of false discovery rate (FDR). Using this method, we determined that the rate of mutations mapping is significant in the following comparison: tumor cells versus nontumor cells (P ≈ 0), PanIN cells versus nontumor cells (P ≈ 0), tumor cells versus PanIN cells (P = 1.04 × 10−11)./p> CDKN2A > SMAD4 > TP53./p>50× coding region coverage in WES or >50 Mb mapped depth in RNA-seq data./p>

Блог

Пространственно ограниченные драйверы и популяции переходных клеток взаимодействуют с микроокружением при необработанном и химиотерапевтическом лечении.