Открытие двух новых изоформ человеческого гена DUT

Научные отчеты, том 13, Номер статьи: 7760 (2023) Цитировать эту статью

659 доступов

Подробности о метриках

В клетках человека описаны две изоформы дУТФазы: одна ядерная (DUT-N) и одна митохондриальная (DUT-M) с родственными сигналами локализации. Напротив, здесь мы идентифицировали две дополнительные изоформы; DUT-3 без сигнала локализации и DUT-4 с тем же сигналом ядерной локализации, что и DUT-N. Основываясь на методе RT-qPCR для одновременного количественного определения специфичности изоформ, мы проанализировали относительные закономерности экспрессии в 20 клеточных линиях человека самого различного происхождения. Мы обнаружили, что изоформа DUT-N экспрессируется на самом высоком уровне, за ней следуют изоформа DUT-M и DUT-3. Сильная корреляция между уровнями экспрессии DUT-M и DUT-3 позволяет предположить, что эти две изоформы могут иметь один и тот же промотор. Мы проанализировали влияние сывороточного голодания на экспрессию изоформ dUTPазы по сравнению с необработанными клетками и обнаружили, что уровни мРНК DUT-N снижались в клетках A-549 и MDA-MB-231, но не в клетках HeLa. Удивительно, но при голодании сыворотки DUT-M и DUT-3 показали значительное увеличение экспрессии, в то время как уровень экспрессии изоформы DUT-4 не показал никаких изменений. В совокупности наши результаты показывают, что запасы клеточной дУТФазы также могут обеспечиваться в цитоплазме, а изменения экспрессии, вызванные голоданием, зависят от клеточной линии.

Полимеразы не могут различать dUTP и dTTP, поскольку они различаются только одной метильной группой, поэтому поддержание соответствующего соотношения dUTP/dTTP имеет первостепенное значение1. Фермент dUTPase отвечает за сохранение целостности генома, катализируя гидролиз dUTP до dUMP и пирофосфата, тем самым удаляя dUTP из пула dNTP2,3. Если dUTP доступен, встроенный урацил расщепляется урацил-ДНК-гликозилазами как часть механизма эксцизионной репарации оснований4. Повышенный уровень dUTP может привести к бестиминной гибели клеток из-за чрезмерной активации процесса репарации ДНК5, чтобы предотвратить это, необходима активность фермента dUTPase. Другая роль реакции, катализируемой dUTPase, заключается в производстве dUMP, который является субстратом для тимидилатсинтазы в пути синтеза dTTP de novo.

На сегодняшний день в литературе описаны две изоформы dUTPазы человека, которые локализуются в ядре и митохондриях соответственно, предположительно для обеспечения регуляции пула dUTP в этих двух ДНК-содержащих органеллах6. Две изоформы кодируются геном DUT и генерируются за счет использования альтернативного промотора в сочетании с альтернативным сплайсингом7,8. Две изоформы различаются только первым экзоном, поскольку митохондриальная изоформа (DUT-M) содержит митохондриальную нацеливающую последовательность, тогда как ядерная изоформа (DUT-N) содержит сигнал ядерной локализации7,9,10. Две изоформы дУТФазы были описаны Ladner et al. с нозерн- и вестерн-блот-анализом на уровне мРНК и белка соответственно7. Уровни экспрессии РНК изоформ в клетках фибробластов легких человека 34Lu также исследовали в условиях сывороточного голодания, которое заставляет клетки выходить из клеточного цикла и переходить в состояние покоя. По данным Ladner et al., этот переход приводит к резкому снижению экспрессии изоформы DUT-N dUTPазы без изменения уровня изоформы DUT-M.

Недавние исследования высокопроизводительного секвенирования предсказали предполагаемое присутствие двух дополнительных изоформ у людей, названных DUT-3 (UniProt ID: A0A0C4DGL3, NCBI RefSeq ID: NM_001025249.1) и DUT-4 (UniProt ID: H0YNW5, NCBI RefSeq ID: NM_001330286.2) в настоящей работе. Базы данных последовательностей показали, что третья предполагаемая изоформа (DUT-3) не содержит никакого сигнала локализации, поэтому, скорее всего, она сохраняется в цитозоле. Вышестоящая часть 5'-UTR-области DUT-3 идентична таковой у DUT-M, однако митохондриальная лидерная последовательность, присутствующая в первом экзоне изоформы DUT-M, отсутствует в изоформе DUT-3. Предполагалось, что четвертая предполагаемая изоформа (DUT-4) будет очень похожа на изоформу DUT-N, отличаясь лишь несколькими аминокислотами на N-конце. Первый экзон этой изоформы расположен в геноме выше остальных изоформ, поэтому его экспрессия может управляться альтернативным промотором для потенциально измененной регуляции этой изоформы. Пока не сообщалось о физиологических уровнях экспрессии или роли этих двух новых изоформ человеческой дУТФазы.